Elektronenmikroskopie: präparationsschritte, ultradünnschnitttechnik,gefrierbruch und gefrierverätzung...

Elektronenmikroskopie Präparationsschritte Ultradünnschnitttechnik Gefrierbruch und Gefrierätzung · Zerkleinerung der Leber · Das Lebergewebe wird in Osmiumtedoxid gelegt → Entwässerung des Lebergewebes → dient zur Fixierung der Leberstückchen (keine Verformung) · Gewebestückchen (schwarz) werden in einem Siebtiegel mit Alkohol gelegt 1.in 70 % Alkohol 2. in 85 % Alkohol 3. in 100 % Alkohol · Gewebestückchen werden in eine Lösung getaucht, die sich mit Alkohol und Kunstharz verträgt · Die Leber wird über Nacht bei offenem Deckel in eine Kunstharzlösung durchtränkt. · Das Gewebe wird in eine Gießform gelegt → Ausgießen der Form bis zum Rand mit flüssigem Kunstharz 1.Aushärten = Polymerisieren in einem Wärmeschrank bei 37°C für 24 h.

2.Polymerisierungsvorgang bei 60°C für 24 h. Ultradünnschnitttechnik · Schnitt in die Gießform → Entnehmung des Präparates · Befestigung im Halter, dann Einspannung im Biokulat, zuspitzen mit Rasierklinge · Schneiden am Ultramikrotom mit dreieckigen Glasmessern in Prismenform mit Auffangtrog ( Wassergefüllt) → Automatischer Vorschub der Halterung · Schnitte schwimmen auf dem Wasser · Schnitte in Interferenzfarben → Kontrastieren der auf Kupfernetz aufgezogenen Schnitte mit Schwermetallionen, die sich an Gewebestrukturen anlagern z.b. Uranylacetat und Bleiacetat. Gefrierbruch und Gefrierätzung · Gewinnung der Oberflächenstruktur · Als Kühlmittel dienen Methanol oder Isopropanol · Abkühlung bis zu – 190°C · Erhaltung der Zellstrukturen Mittels der Gefriertechnik lassen sich sehr schöne plastische Eindrücke von Oberflächenstrukturen gewinnen.

Gefrierätzung · Ergänzung der Ultradünnschnitttechnik · Erfassung zellulärer Feinstrukturen, speziell von der äußeren und inneren Zellmembran · Modifizierte Bedampfungsanlage · Schockfrierung der Probe → Befestigung auf den Kühltisch der Anlage · Mikrotommesser → Absprengung des Präparats, Entstehung eines Gefrierbruchs · Sublimation (Ätzen) der Bruchstelle · Bedampfung des erhaltenen Oberflächenabdrucks eines mit Platin schräg bedampften Kohlefilms · Ablösung und Reinigung der Kohle-Platin-Schicht vom Objekt Zellfraktionierung Trennung und Anreicherung der Zellorganellen · Homogenisieren: Zerkleinerung des Gewebes in einer Lösung, die einen ähnlichen osmotische Wert hat wie das Zellinnere ® Gemisch aus verschiedenen Zellbestandteilen Zellhomogenat · Zentrifugieren: Trennung der Zellbestandteile · Große und schwere Zellbestandteile setzen sich schon bei niedriger Drehzahl als Sediment ab. · Der Überstand (Flüssigkeit darüber) enthält kleine und leichte Zellstrukturen ® erneutes Zentrifugieren bei höherer Drehzahl · Mehrmaliges Zentrifugieren dient der Auftrennung der Zellbestandteile ® differenzielle Zentrifugation · einmaliges Zentrifugieren trennt die Bestandteile ähnlicher Größe aber verschiedener Dichte ® Dichtegradientenzentrifugation ¯ dient zur Feinauftrennung von Proben die schon durch die differenzielle Zentrifugation gereinigt sind, aber auch zur Isolierung von Makromolekülen

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